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外文翻譯---在酪干乳桿菌BL23的LDH基因分析:乳酸生產上的作用-其他專業.doc

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外文翻譯---在酪干乳桿菌BL23的LDH基因分析:乳酸生產上的作用-其他專業.doc

英語外文翻譯作業 外文資料翻譯譯文 在酪干乳桿菌BL23的LDH基因分析乳酸生產上的作用 Juan Rico Mara Jess Yebra Gaspar Prez-Martnez Josef Deutscher Vicente Monedero 收稿日期2007年12月21日/接受日期2008年1月13日/發表時間2008年1月30日 學會工業微生物2008 摘要干酪乳桿菌是一種通過通過L-乳酸脫氫酶(LDH1)的作用促使糖發酵主要生產L-乳酸的乳酸菌。此外,D-乳酸的異構體的少量產生一個D-hydroxycaproate脫氫酶(HicD)的活動。LDH1是主要的L-乳酸生產酶,但突變它的基因并沒有消除L-乳酸的合成。一項稱作 “干酪乳桿菌基本法第二十三條草案的基因組序列”的調查揭示了相關的另外三個基因編碼乳酸脫氫酶旁系。為了研究這些基因對全球的這種微生物的貢獻,個體乳酸以及雙突變體(LDH1 LDH2,LDH1 LDH3,LDH1,LDH4和LDH1hicD)的生產,構建了乳酸生產的上清培養評估。 LDH2,LDH3和LDH4基因乳酸生產中發揮的作用不大,因為他們的單一突變或在組合與LDH1缺失突變對L-乳酸合成的影響很小。ΔLDH1突變體顯示D-乳酸產量增加,這是可能通過活動HicD合成,因為它是在取消ΔLDH1 hicD的雙突變。相反,可能是HicD,在沒有LDH1,LDH2,LDH3或LDH4活動的情況下通過酶譜分析檢測。此外,這些檢測發現存在額外的頻段表現出D-/L-lactate脫氫酶活性,這不能歸咎于任何所描述的基因。這些結果表明,L-BL23具有一個復雜的酶系統,能夠減少乳酸丙酮酸。 關鍵詞干酪乳桿菌、乳酸菌、Hydroxycaproate脫氫酶、乳酸脫氫酶、代謝工程 簡介糖代謝乳酸菌(LAB)的特點是通過乳酸脫氫酶的作用主要發酵生產乳酸產品,從而降低丙酮酸,乳酸。從生物技術的觀點來看乳酸的生產是非常重要的,因為它可以產生許多自然發酵的實驗室資源,它可以用在食品,制藥和生物聚合物產業[7]。在乳酸菌干酪BL23,一些菌株已被廣泛用于遺傳,生理和生化研究,這兩個基因編碼的蛋白質乳酸脫氫酶活性已被描述[8,12,19]。 LDH1基因編碼合成的L-LDH,而hicD編碼一個D-hydroxyisocaproate提供了D-乳酸脫氫酶。在這種細菌[19]上與突變株相關的L-乳酸和D-乳酸的形成表明突變株已在這兩個基因上建成。然而,干酪乳桿菌BL23顯示LDH1突變體仍然產生大量的L-乳酸D-乳酸。一個與其他實驗室刪除LDH基因相似的行為也有報道。在這個意義上說,基因突變從植物乳桿菌的L型和D型上開始編碼,使該生物體產生50%的D型跟50%L型的混合物,從來沒有導致乳酸生產[3]的完全缺失。 1乳酸乳桿菌sakei的突變,在缺乏D-乳酸脫氫酶活性酸菌的條件下,將導致具有強烈降低L型和D型的乳酸的菌株生產(D異構體在消旋活動的作用下能夠轉換成L Dlactate)但仍然產生少量的乳酸[15]。最后乳酸菌的發酵在ldhL 、ldhD雙基因剔除的情況下仍然能夠合成乳酸[1]。 EVorts已作出建設在一個aVected或乳酸菌菌株上的幾個的identiWed LDH基因,因為它們可以用在通過非消旋,光發酵等途徑生產活性乳酸[1]。此外,代謝工程戰略應用于NADH氧化再加上一個替代的丙酮酸的代謝,導致附加代謝產物的產生[4,6,13,17]。然而,已知的缺失乳酸脫氫酶基因的結合酶活性的表達并不總是能夠降低丙酮酸suYcient改道對其他分子比如signiWcant丙酮酸XOW乳酸diVerent的影響。由于這些原因,一個更好的涉及乳酸合成酶的研究將成為必要。在嘗試探索的基因負責殘留在干酪乳桿菌乳酸生產BL23的LDH1突變體,我們探索其是否存在額外的LDH基因突變以及在eVects乳酸生產上新發現的LDHs的基因組。 材料和方法 菌株和生長條件 在這項研究中干酪乳桿菌菌株的使用在表1中列出。他們生長在MRS培養基(Oxoid公司)或MRS基本培養基中,每公升含蛋白胨10克,肉類提取物8克,酵母提取物4克,吐溫80,1毫升,K2HPO42克;檸檬酸銨2克; MgSO4.7H2O,0.2克;MnSO4.4H2O,0.05克,并輔以0.2%(W / V)葡萄糖,在37℃下靜置。大腸桿菌DH5α是作為一個克隆宿主,在LB培養基中37℃條件下攪拌生長,對于選擇干酪乳桿菌的轉化體,將5克/毫升的紅霉素加入培養基中。氨芐青霉素則用在100克/毫升大腸桿菌中。 質粒和突變株的構建 pRV300質粒[11]用于興建綜合載體內部碎片的L.casei,LDH2,LDH3,LDH4。一個519 bp的片段從LDH2 ampliWed PCR結合寡核苷酸5ˊ-GATTCCCTACCTTACACG和5ˊ-TCTCAATGATGCCATAAGC與EcoRV分為pRV300消化的克隆,給予pRVldh2。一505 bp的LDH3內部片段是與5ˊ-GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC和5ˊ-GCTTAGCCTGATAAA與SMAI消化TCTTC和克隆到pRV300給pRVldh3。 LDH4的437 bp的片段,ampliWed 5ˊ-TCTCAATTCAGCGATGGC和5ˊ-CTACATCATCAGATGCG和克隆到EcoRV消化pRV300來給pRVldh4。要構建的PRV ΔLDH1質粒攜帶融合5ˊ和 3ˊ的LDH1區域,500 bp的片段相應LDH13ˊ下游地區與寡核苷酸5ˊ-CGACACCGAGA ampliWed ATTTCTGTG和5ˊ-ACATGGATGGTCAATATGGC并克隆到pRV300用EcoRI消化(作出鈍的Klenow DNApolI的片段)。另外有500 bp的5ˊLDH1在上游區域與寡核苷酸 ampliWed 5ˊ-CGGGGTACCGTCGTTTGGCCAAGCCATC和 5ˊ-TTCAAGCAAGCTTCCAATAAC并克隆到上述質粒PSTI(消化鈍與Klenow酶)。克隆含有質粒與導致在正確的方向碎片被identiWed限制分析,并命名為PRVΔLDH1。 PCR的進行與展開高精度聚合酶(Roche)從桿菌屬BL23染色體DNA。 PCR產物凝膠puriWed的gfx-PCR puriWcation試劑盒(GE醫療機構)。限制性內切酶,DNA的modiWcation酶和T4連接酶為New England Biolabs公司和Roche公司生產。 干酪乳桿菌菌株的轉化 pRVldh2,pRVldh3,pRVldh4和pVBhic[19]通過GenePulser儀(BioRad公司)和MRS平板轉化紅霉素。通過與相應的寡核苷酸和DNA聚合酶鏈反應轉化在正確的位點整合測試。構建LDH1缺陷菌株,干酪乳桿菌BL23通過克隆選擇轉化為PRVΔLDH1和耐紅霉素。一些克隆體在含有紅霉素的MRS培養基上生長約200代沒有產生抗生素,稀釋過后培養的菌種亦是如此。 BL249(ΔLDH1)被選定為第二應變基因重組導致質粒切除留下缺失性的LDH1,經PCR conWrmed執行從敏感紅霉素克隆的DNA的分離。 有機酸和葡萄糖的測定 干酪乳桿菌細胞培養初期在輔以0.2%葡萄糖的MRS培養基上培養。有機酸上清液用JASCO PU-2080Plus HPLC系統,耦合紫外檢測器(210 nm),以及使用Rezex ROAOrganic色譜柱進行測定。色譜法在50C與5 mM的硫酸作為溶劑,XOW速率 0.6毫升/分鐘的條件下進行。 D-乳酸和L-乳酸的同分異構體的比例來自R-Biopharm公司的D-/L-lactic酸性試劑盒上(德國達姆施塔特公司)。目前在生長培養基中的糖的測定方法來自R-Biopharm公司的D-葡萄糖試劑盒。 表1菌株和質粒 乳酸脫氫酶酶譜分析 細胞成倍生長在10毫升的MRS培養基中的干酪乳桿菌野生型和突變株通過離心回收,用100毫摩爾的Tris-HCl 在pH值7.4條件下在同一buVer中加入 1毫摩爾 硫代-1 ,4-threitol 0.5毫摩爾phenylmethylsulphonyl的xuoride洗滌。晃動玻璃珠使細胞被打破用迷你Beadbeater(直徑0.1毫米)(Biospec)在12000轉4C條件下離心10分鐘去除細胞碎片。細胞的提取物被加到了6%的非變性PAG和稀釋的90V中,在加入100mM pH值6.8的三乙醇胺buVer,0.75 mM的NAD,0.1毫克/毫升硝基四氮唑,0.02毫克/毫升的phenazyne methosulfate,或者200mM的L-乳酸或200mM的有50%的D-乳酸50%的L-乳酸的混合物的凝膠電泳培養后檢測乳酸脫氫酶活性。在第二個用含有10%的PAG電泳進行檢測0.05%SDS。凝膠浸泡60分鐘,在2%的Triton X-100中消除SDS并轉移到一個含有100mM三乙醇胺buVer pH值6.8,10mM果糖-4,6 - 二磷酸,1mMNADH和25mM丙酮酸鈉的途徑,培養60分鐘后,凝膠用清水沖洗30分鐘置于含有0.25毫克/毫升硝基四唑和0.02毫克/毫升phenazyne methosulfate中培養。蛋白質的頻段為在一個黑暗背景下的清晰條帶證明了NADH的氧化酶活性。 核苷酸加入編號 本文報道的核苷酸序列已在EMBL數據庫存依次加入數字序號AM886174,AM886175,AM886176和AM886177。 結論 LDH的同源基因存在于干酪乳桿菌BL23的基因組干酪乳桿菌,除了先前描述的乳酸脫氫酶BL23 [8,19],在研究LDH同源性BLAST搜索干酪BL23基因組草圖(96%的序列覆蓋率)呈現三個額外的推測LDHs的基因編碼。 “三個額外的LDHs(LDH2,LDH3和LDH4)百分比49,31和24%,當與干酪乳桿菌BL23LDH1酶相比。 LDH2具有乳酸/蘋果酸脫氫酶的同源性,而LDH3是相似的L-hydroxyisocaproate細菌脫氫酶。在LDH4中,序列在80左右開始的氨基酸的同源性為L型LDHs,而WRST N-末端氨基酸只共享1 signiWcant,N-末端的二級乳酸脫氫酶的同源性從乳酸乳球菌(LDH-2)。對LDHs序列的推斷發現,類似于LDH1,LDH2和LDH3蛋白質進行守恒的NADH結合域中含有典型的G-X - G - X - X – G紋路(X為任意氨基酸 圖1示意圖4-diVerent LDH基因檢測干酪乳桿菌基本法第二十三條連同他們的基因組范圍內。灰盒對應序列潛水員從L-干酪ATCC334。莖環代表假定的轉錄終結 酸)。此外,催化的M-G-E-H型的G- [D/E] - [S/T]位點的研究,其中H是催化組氨酸,同時也表現在LDH2和LDH3中,從而支持了潛在的乳酸脫氫酶的假設編碼。 LDH4的酶是展示以LDH1的最低相似性和保持上述最差的序列。為了分配假定的設想,對新的蛋白質的遺傳背景其相應的基因進行了研究(圖1)。正如前面描述,LDH1是monocistronic基因并沒有位于它旁邊的基因碳代謝。 LDH2是通過divergently轉錄GDH基因編碼在Xanked五肽尾的NADP依賴谷氨酸脫氫酶在三肽尾由基因編碼假定的氨基酸酸和羧酸轉運。雖然LDH2似乎也是monocistronic的基因,但LDH2擁有在一些二元酸反應步驟的脫氫作用證明它是合理的。 LDH3是Xanked編碼基因假定的脫乙酰基酶,膜蛋白和ADPribose焦。 LDH4是位于在3ˊ肽尾一個丙酮酸diVerent亞基編碼基因簇脫氫酶復合體,似乎形成一個操縱子一個保護假設蛋白和編碼假定基因古型果糖-1,6-二磷酸酶的inositolmonophosphatase種群。雖然丙酮酸脫氫酶是復雜的,因為它涉及在好氧條件下將丙酮酸的代謝產物轉換成乙酰輔酶A的化合物,果糖-1,6-二磷酸酶在糖質新生途徑,因此沒有與LDH有明確的聯系。總之,基因組內新的LDH基因沒有允許建立可能的假設細胞的作用。進行了類似的搜索使用研究干酪ATCC334的完整的基因組序列[14],新提出的干酪乳桿菌型應變,揭示了相同的額外LDH基因的發生。遺傳結構是相同的DNA攜帶的LDHs菌株除外(1)在ATCC334中,GDH基因(LSEI_0635)相鄰LDH2和公認的脯氨酸iminopeptidase基因(LSEI_2604)接近LDH3的是假;(2)IS3相關插入元素,是目前在ATCC與334, LPDA與LDH4之間;(3)基因編碼推測PADR在BL23的缺失似乎是從ATCC 334開始;(4)基因編碼的一種應激反應膜在ATCC334(LSEI_1313)GTP酶是一個BL23的假基因(圖1)。 構建不同LDH突變及其乳酸生產效果 在以前的工作,LDH1構建插入突變一個非復制的質粒攜帶一個內部片段基因[19]。為了產生一個穩定的突變并避免抗生素抗性標記的存在,L.干酪基本法第二十三條轉化質粒PRV LDH1,其中進行的5和3 LDH1 Xanking地區。后WRST單交叉融合,是一個穩定的突變選擇進行了第二次重組事件,從而導致了LDH1完整的染色體缺失。時相比,野生型,新的刪除突變(株BL249)表現出類似的行為以前插入突變BL176培養上清總是達到了較高的Wnal pH值,它產生的CO2粗提取物中葡萄糖和L-LDH活性降低95%(數據未顯示)。隨后,LDH2,LDH3,LDH4和hicD基因滅活LDH1背景提供四個雙突變(表1)。在以類似的方式,在LDH2,LDH3和LDH4在干酪乳桿菌的野生型基因被滅活,發出三個diVerent單突變體(表1)。為了研究上eVect的diVerent突變乳酸生產,所有菌株生長在含0.2%葡萄糖和乳酸的MRS培養基上測得完成后對葡萄糖的利用。表2中可以看到,LDH1突變對主要乳酸生產的影響,以減少乳酸總額的37%的增幅,對D-乳酸進行了觀察。 LDH2,LDH3和LDH4單突變體的表現像野生型(數據未顯示)。此外,結合LDH2,LDH3或LDH4突變及LDH1缺失沒有產生明確一個總的eVect乳酸生產,雖然,D-/L-lactate比例上升超過雙重LDH1 LDH2和LDH1 LDH4相比單LDH1的突變。這些結果表明,在沒有LDH1的條件下,要么LDH2或LDH4,HicD或其它的D-乳酸產酶可能減少丙酮酸率較高(見表2)。有趣的是,增加的D-乳酸生產LDH1應變在LDH1 hicD雙突變中完全消失。這種conWrmed,在LDH1缺失的條件下,HicD酶是負責輸送丙酮酸以實現D-乳酸的生產。正如前面觀察,LDH1突變導致增加生產丙酮酸和葡萄糖發酵過程中的醋酸[19]。然而,在hicD突變過程中,小野生型的D-乳酸的生產仍在觀察。乳酸脫氫酶的酶譜檢測活動的乳酸LDH2,LDH3和LDH4突變的低eVect,合成促使我們尋找額外的存在LDH活性存在于干酪乳桿菌BL23,我們試圖將粗提取物進行酶譜分析檢測。在1 WRST一系列的實驗,細胞提取物的幾株被裝上非變性凝膠和氧化的能力乳酸,加上減少的色基板四氮唑藍(圖2)。 A頻段展現出D-乳酸脫氫酶活性,并為缺失在hicD突變體被明確檢測(圖2a),這表明它是產物的hicD基因。相反,其余的突變并沒有產生1 diVerent的則帶proWle,因此,沒有蛋白帶可以分配到產物或LDH1,LDH2,LDH3或LDH4。單體LDH2,LDH3或LDH4突變株攜帶像野生型(數據未顯示)的表現。允許使用1 D-/L-lactate混合物簡單檢測 圖2 diVerent干酪乳桿菌株對本地凝膠LDH酶譜分析。5050混合的D-和L-乳酸開發出一種凝膠,B膠開發L-乳酸。箭頭指向參展乳酸脫氫酶的蛋白條帶活動。樂隊相應的HicD酶被標記面板A.菌株是“基本法”第二十三條(野生型); BL249(LDH1); BL274(LDH1hicD); BL189(hicD); BL252(LDH1 LDH2); BL271(LDH1 LDH3)BL273(LDH1 LDH4) 帶凝膠與Llactate培養時缺失而且被分配到一個額外的酶展現的D-乳酸脫氫酶(箭頭1圖2A)。此外,帶L-乳酸脫氫酶活動檢測所有凝膠軌道。這個在任何的LDH突變過程中沒有消失的頻段是增加攜帶LDH1缺失株的信號,提示它對應酶的活性,這是誘導后LDH1突變(箭頭2圖2a,b)的。類似結果也存在于含有或缺乏果糖1,6-二磷酸的過程中,這是LDH1激活(數據未顯示)。在第二組實驗中,細胞提取物在SDS-PAGE和SDS被去除之后被解析出來,由于NADH的氧化能力蛋白質在凝膠中是可見的。圖3顯示,再次表現出NADH的蛋白條帶只能是存在的具有氧化酶的活性的丙酮酸分派給產物hicD所致。一個沒有丙酮酸控制凝膠除外,HicD帶了相同的結果缺失(數據未顯示)。此外,兩個頻段在丙酮酸缺失的情況下展現出NADH氧化酶的活性 表2從葡萄糖生產幾種干酪乳桿菌菌株的有機酸 圖3 NADH的氧化酶中存在丙酮酸酶譜分析的diVerent干酪乳桿菌菌株的無細胞提取物上SDSPAG解決處理鈥淢動脈插管和方法鈥箭頭參展的NADH氧化活性增加蛋白質點中LDH1背景。的HicD酶的立場是標有一個箭頭。株是“基本法”第二十三條(野生型); BL249(LDH1); BL274(LDH1 hicD); BL189(hicD); BL252(LDH1 LDH2);BL271(LDH1 LDH3)和BL273(LDH1 LDH4) 檢測和強度增加了LDH1背景(圖3)。 討論 LAB的遺傳菌株modiWcation已被用于對工業生產或食品相關的分子代謝的途徑的改變。LDH-編碼基因的突變是實現這一目標的一個重要工具,因為它會產生氧化還原失衡,這可以彌補同源NADH氧化的新化合物的合成外源酶的表達[4,9,17,20]它提供了丙酮酸代謝替代途徑[6,13,18]。然而,這些方法有時導致所需產物的產量降低。在其他因素方面,這可能會產生氧化增加NADH的其他途徑(即乙醇生產)和替代LDH基因[13]的表達。在這種情況下,基因組重要的工業可用性微生物是在發展至關重要新戰略旨在改善應變。在這工作中,我們試圖確定是否四個基因的研究BL23基因組假設干酪乳酸脫氫酶編碼將有助于乳酸合成。LDH1突變有一個顯著的來自干酪乳桿菌的eVect代謝反應,盡管在突變株測得LDH的活性偏低,但它仍然產生了相當大數量的L-乳酸。兩種可能性可以解釋(1)檢測乳酸最佳實驗條件額外的LDH酶(S)或脫氫酶的活性在起作用(2)一個非常低的LDH活性,就足以讓乳酸在低濃度下大幅度堆積增長。在的johnsonii乳酸菌中,基因編碼的D-乳酸脫氫酶的失活,導致LDH活性[10]降低超過85%,而總乳酸產量只有降低了16%,表明乳酸脫氫酶的酶是目前過剩丙酮酸轉化的原因。不管怎樣,負責在L型干酪L乳酸的生產酶是未知的。新的identiWed的貢獻是證明了LDH2,LDH3和LDH4的乳酸產量低,而且只有reXected小在D-/L-lactate比例變化雙突變體。存在這樣的可能性,它們在一個基因deWciency上的編碼可以彌補另外兩個基因多余的LDH。這一假說可以證明,如果三聯或四聯的突變體在LDH將產生新的基因。此外,存在表現出LDH活性酶譜分析的額外波段指向存在其他unidentiWed酶能降低丙酮酸,乳酸。我們的研究結果conWrm證明了先前的假設,HicD負責在D-乳酸水平LDH1的情況下[19]增加。這種eVect菌在LDH1 hicD雙突變的情況下完全恢復。因此,它的出現,說明HicD酶只有在對乳酸丙酮酸Xux對主要的乳酸脫氫酶活動的終止作用可能占了相當大的一部分。這可能是reXects較低的aYnity與HicD丙酮酸相比,得到LDH1。相反,aYnities為丙酮酸HicD和額外的L型LDH酶可能是類似的。一個附加的HicD探索在BL23基因編碼的酶的基因編碼為33%HicD的蛋白,,這是100%的同源性到LSEI_2156,存在的ATCC334基因組[14]。此外,酶譜分析表明,微弱的波段與HicD活動相關。盡管這種推測HicD酶發揮了D-乳酸合成的作用仍有待證明。但在先前的一份報告中,hicD的突變導致幾乎測不到D-乳酸水平[19]。然而,目前的實驗結果表明,少量生產的Dlactate在hicD株野生型中更加持久。這些diVerences可能是的diVerent培養的因果條件。相似的,一些學者報道,一個研究桿菌ldhL ldhD雙基因剔除的條件下產生12-14mM乳酸[3],而其他作者的報道60mM乳酸可產生類似的葡萄糖量[13]。雖然LDH1在BL23的干酪乳桿菌負責主要的LDH活性,但這種蛋白質不能被檢測酶譜分析。因此,這種酶不遷移,在非變性凝膠是不可逆轉的,經SDS或滅活其活性丟失后凝膠電泳是可能的。然而,酶譜分析conWrmed在干酪乳桿菌BL23兩個NADH的氧化酶誘導LDH1突變,這說明了細胞如何響應試圖以彌補缺乏通過乳酸脫氫酶NADH再生。NADH / NAD LDH1缺失造成的不平衡可部分彌補NADH的表達,這可能是對O2的依賴,并在一些實驗室的氧化酶占相當比例的NADH的循環利用[5]。事實上,干酪乳桿菌LDH1突變株在通氣條件下增長較快[19],BL23的基因組檢測表明,至少有三個公認的NADH的氧化酶(數據編碼未顯示)。存在一個額外的頻段表現出L型LDH在酶譜的活動表明,酶法機械干酪乳桿菌BL23的丙酮酸減少是比預期更復雜的。有趣的是,作為顯示引起NADH的氧化酶,這種活動較高時LDH1缺失。在一些實驗室,在好氧生長誘導氧依賴于NADH的氧化酶[5]和研究上的變化在LDH糖代謝的基因剔除株[3,16,19]揭示了一個深刻的代謝調整對NAD再生替代途徑。LDH干酪乳桿菌BL23 deWciency是復雜的,它涉及丙酮酸Xux不僅變化,但也丙酮酸和NADH代謝相關蛋白的誘導。這強調需要一個更深層次干酪乳桿菌代謝的知識為基礎,這些化合物進一步的代謝工程的方法。 致謝 J. Rico的是關于Corporacion AlimentariaPeasanta部分資金中船重工研究生獎學金獲得者,在大學的L. casei BL23的基因組進行測序,卡昂,Laboratoire德Microbiologie DE LENVIRONNEMENT,在非洲自然資源Thiverval-Grignon,Microbiologie等GntiqueMolculaire研究所Agroqumica?TECNOLOGIA的Alimentos,中船重工,從事諾曼底地區和非洲自然資源組織成員Wnancial的助手。 參考文獻 1.Aarnikunnas J, von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A乳酸菌發酵的代謝工程(2003)甘露醇和純L-乳酸或丙酮酸生產.生物工程Bioeng82653-663 2. Bongers RS, Hoefnagel MH, Starrenburg MJ, Siemerink MA, Arends JG, Hugenholtz J, Kleerebezem M(2003)J,IS981-介導的建國,適應性進化ldhB轉錄恢復生產乳酸激活中的乳酸乳酸脫氫酶deWcient的應變乳. J Bacteriol1854499-4507 3. Ferain T, Schanck AN, Delcour J(1996)C-13核磁共振葡萄糖和檸檬酸的終端產品在ldhLldhD共振分析雙淘汰賽株植物乳桿菌.J Bacteriol 1787311-7315 4. 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Society for Industrial Microbiology 2008 Abstract Lactobacillus casei is a lactic acid bacterium that produces L-lactate as the main product of sugar fermentation via L-lactate dehydrogenase Ldh1 activity. In addition,small amounts of the D-lactate isomer are produced by the activity of a D-hydroxycaproate dehydrogenase HicD.Ldh1 is the main L-lactate producing enzyme, but mutation of its gene does not eliminate L-lactate synthesis. A survey of the L. casei BL23 draft genome sequence revealed the presence of three additional genes encoding Ldh paralogs. In order to study the contribution of these genes to the global lactate production in this organism, individual, as well as double mutants ldh1 ldh2, ldh1 ldh3, ldh1 ldh4 and ldh1 hicD were constructed and lactic acid production was assessed in culture supernatants. ldh2, ldh3 and ldh4 genes play a minor role in lactate production, as their single mutation or a mutation in combination with an ldh1 deletion had a low impact on L-lactate synthesis. A _ldh1 mutant displayed an increased production of D-lactate, which was probably synthesized via the activity of HicD, as it was abolished in a _ldh1 hicD double mutant. Contrarily to HicD, no Ldh1, Ldh2, Ldh3 or Ldh4 activities could be detected by zymogram assays. In addition, these assays revealed the presence of extra bands exhibiting D-/L-lactate dehydrogenase activity, which could not be attributed to any of the described genes. These results suggest that L.casei BL23 possesses a complex enzymatic system able to reduce pyruvic to lactic acid. Keywords Lactobacillus casei Lactic acid Lactate dehydrogenase Hydroxycaproate dehydrogenase Metabolic engineering Introduction The metabolism of sugars by lactic acid bacteria LAB is characterized by the production of lactate as the main fermentation product via the action of lactate dehydrogenase,which reduces pyruvic acid to lactic acid. Lactic acid production is important from a biotechnological point of view,as it can be produced by LAB fermentation of many natural sources and it can be used in the food, pharmaceutical and biopolymers industries [7]. In Lactobacillus casei BL23, a strain

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